Экспрессия OmpU, белка наружной мембраны Vibrio cholerae, позитивно регулируется toxR, который также регулирует критические факторы вирулентности, такие как холерный токсин и фактор колонизации – токсин-корегулируемые пили. В данном исследовании, мы характеризовали 38 кДа OmpU белок и исследовали его роль в адгезии V. cholerae к клеткам млекопитающих. Аминотерминальный сиквенс OmpU был схож с сиквенсом адгезинов HMW1 и HMW2 Haemophilus influenzae, который в свою очередь был схож с сиквенсом филаментозного гемагглютинина Bordetella pertusis. Моноклональные антитела, полученные к FHA, узнавались и OmpU V. cholerae и OmpA Escherichia coli, а поликлональные анти-OmpU антитела узнавались FHA и OmpA E. coli, предполагая существование общих эпитопов для этих белков. OmpU строго опознавался конвалесцентно-фазной сывороткой, от волонтеров экспериментально инфицированных вирулентными штаммами V. cholerae, показывая, что OmpU является иммуногенным и продуцируется in vivo. OmpU селективно связывался с фибронектином и с аргинин-глицин-аспарагиновым (RGP) трипептидом, но не с другими протестированными гликопротеинами, такими как коллаген и ламинин. Антитела, полученные к OmpU или его F(ab)2 фрагментам, полностью ингибировали адгезию некоторых штаммов V. cholerae к эпителиальным клеткам HeLa, HEp-2, Caco-2 и Henle 407, а также ингибировали колонизацию кишечника и сообщали протекцию новорожденным мышам к обоим биотипам (El Tor и классический) V. cholerae 01. В совокупности эти данные показывают, что OmpU обладает адгезивными свойствами, которые могут играть роль в патогенезе холеры.
Введение
V. cholerae вызывает холеру за счет колонизации кишечника и выработки мощного энтеротоксина – холерного токсина (СТ). Хотя токсин, ответственный за особую дегидратирующую диарею, хорошо охарактеризован, адгезины, ответственные за колонизацию тонкого кишечника, охарактеризованы не в полной мере. Некоторые потенциальные факторы адгезии были описаны для V. cholerae включая поверхностные белки, гемагглютинины, некоторые типы пилей. Токсин-корегулируемые пили (ТСР) были существенны для кишечной колонизации штаммом 395 классического биотипа в мышах и людях, а оба ТСР и маннозо-чувствительный гемагглютинин (MSHA) выступали в роли важного фактора колонизации для штаммов биотипа El Tor. Колонизация кишечника комплексный процесс, возможно вовлеченный последовательно или параллельно экспрессии некоторых факторов.
Продукция токсина у V. cholerae является частью регуляторного ответа, в котором некоторые другие факторы вирулентности вдобавок к СТ экспрессируются под контролем центрального регулятора, ToxR. Было описано не менее 17 ToxR-активируемых генов, включая гены, кодирующие СТ, фактор колонизации ТСР, дополнительный фактор колонизации и белки наружной мембраны (OMPs) OmpU и OmpT. Экспрессия СТ, ТсрА, OmpU и OmpT оказывает воздействие за счет изменения в осмолярности и аминокислотной концентрации, не смотря на то, что другие сигналы окружающей среды, такие как температура и рН, имели больший произведенный эффект на экспрессию СТ и ТсрА, чем на OMPs. 38 кДа OmpU и 40 кДа OmpT регулируются противоположными способами, таким образом экспрессия OmpU позитивно регулируется ToxR, а экспрессия OmpT негативно.
Не смотря на то, что некоторые гены toxR регулона, такие как ctx и tcpA, были клонированы, а их белковые продукты были существенно охарактеризованы, другие ToxR-регулируемые факторы, такие как OmpU не были исследованы детально. В этой статье мы описываем биохимическую, иммунологическую и функциональную характеристику OmpU и представленные данные показывают, что этот белок может быть фактором адгезии V. cholerae.
Дискуссия
OmpU ОМР V. cholerae первоначально был описан как часть toxR регулона этого вида. Хотя множество других генов регулируемых ToxR были клонированы и охарактеризованы, включая гены, кодирующие СТ, ТСР и дополнительный фактор колонизации, OmpU не был ранее охарактеризован либо на функциональном либо генетическом уровне. Факт того, что экспрессия OmpU корегулируется с экспрессией критических факторов вирулентности, таких как СТ и ТСР, предполагает, что OmpU также является важным фактором вирулентности для этого вида. Мы здесь представили доказательство того, что OmpU действует как фактор адгезии, вовлеченный в колонизацию эпителиальных клеток V. cholerae.
Мы изучали адгезию OmpU к фибронектину, коллагену, ламинину и RGD-трипептиду, и обнаружили, что OmpU связывался с фибронектином и RGD. Хотя уместность этих результатов in vivo неизвестна, они указывают на то, что OmpU может связываться с компонентами эукариотических клеток. Далее мы исследовали роль OmpU в адгезии V. cholerae к культуральным эпителиальным клеткам. Все протестированные штаммы V. cholerae 01 обнаруживали адгезивность к НЕр-2 клеткам, и полное ингибирование адгезии в присутствии поликлональной антисыворотки к OmpU. Очищенные F(ab)2 фрагменты этой сыворотки также ингибировали адгезию, показывая, что ингибирование адгезии антисывороткой не было обусловлено неспецифическим ингибированием Fc фрагментом антител. Адгезия V. cholerae к НЕр-2 клеткам не опосредовалась ТСР, так как производная штамма 395 специфически мутированная в tcp гене адгезировалсь на НЕр-2 клетках, с уровнем сопоставимым с уровнем проявленным штаммом 395, а антисыворотка к ТСР не ингибировала адгезию V. cholerae к НЕр-2 клеткам.
Прототипный штамм, недавно появившейся 0139 серогруппы (AI1837), также проявлял адгезивность к НЕр-2 клеткам. По контрасту с результатами по 01 штаммам, адгезивность не ингибировалась ни анти- OmpU антисывороткой, ни ее F(ab)2 фрагментами. Хотя этот штамм имел полисахаридную капсулу, которая возможно, препятствует антителам взаимодействовать с OmpU. Когда в этом исследовании тестировались бескапсульные мутанты (1A и Е6), они проявляли слабую адгезивность к НЕр-2 клеткам, но эта адгезия не ингибировалась анти-OmpU сывороткой. Единственное вероятное объяснение этих результатов то, что для 0139 серогруппы и полисахаридная капсула и OmpU могли опосредовать адгезию к культуральным эпителиальным клеткам. Это также показывает, что капсулированные клетки V. cholerae 0139 имеют тенденцию к агглютинации, которая способствует адгезии к кишечной мукозе человека.
Количество OmpU продуцируемое различными штаммами V. cholerae не идентично. Экспрессия OmpU ToxR- мутантами была редуцирована, но не тотально, предполагая, что OmpU может иметь конститутивную экспрессию, которая не зависит от ToxR. Адгезия ToxR- мутантов к НЕр-2 клеткам также редуцирована по сравнению с изогенным предковым штаммом. Штамм 569В тоже продуцирует OmpU меньше чем CVD101, предок штамма 395. Ослабление экспрессии OmpU у этого штамма коррелирует с редукцией адгезии к НЕр-2 клеткам, так как адгезия 569В была меньше в 14 раз относительно адгезии CVD101, предка 395. Штамм 569В несет хромосомальную делецию toxS гена, которая поражает экспрессию СТ, и эта мутация может также иметь эффект на экспрессию OmpU. Этот штамм также проявляет уменьшение в кишечной колонизации у людей, мышей и кроликов.
CVD103-HgR продуцировал меньшее количество 38 кДа OmpU белка и низкий уровень адгезии к НЕр-2 клеткам. CVD103-HgR, предок CVD103, который в свою очередь произошел от 569В. CVD103-HgR, был выделен из стула иммунизированных волонтеров в меньшем количестве, чем CVD103 или 569В, а количественные исследования на мышатах показали, что кишечная колонизация CVD103-HgR была меньше относительно CVD103 или 569В. Взаимосвязь экспрессии OmpU и адгезии in vivo или in vitro, хотя и согласуется с ингибиторным эффектом, наблюдаемому с анти-OmpU сывороткой, возможна лишь до тех пор, пока изогенные штаммы, отличающиеся по оmpU локусу, являются конструктивными и тестовыми.
Вдобавок к in vitro исследованиям подтверждающими роль OmpU как фактора адгезии, in vivo доказательства такой роли еще ищут. OmpU, по-видимому, экспрессируется in vivo, в процессе инфицирования человека, так как постответная сыворотка волонтеров снабженных V. cholerae 395 и Е7946 строго узнает OmpU. Не смотря на то, что OmpU слабо узнается доответной сывороткой этих волонтеров, что может быть обусловлено тем фактом, что OmpU совместно использует эпитопы с OmpA E. coli. Когда тестирование производили на модели мышей сосунков, обе цельные антисыворотки полученные против OmpU и очищенных F(ab)2 фрагментов этой антисыворотки сообщали протекцию к V. cholerae обоих биотипов. Sengupta et al. ранее сообщали, что антитела направленные против OMPs V. cholerae 40-43кДа, обеспечивали 80% протекцию к V. cholerae 01, на модели мышат сосунков. Исследование SDS-ПААГ опубликованное этими исследователями предполагает, что эта протективная фракция, вероятно, включает OmpU.
Среди потенциальных факторов кишечной колонизации V. cholerae, ТСР наиболее твердо доказан. Работы Rhine и Taylor, Sun et al. и Taylor et al., показывают, что мутация tcpA значительно редуцирует кишечную колонизацию у мышей сосунков, а антитела против ТСР могут защищать мышей от обоих биотипов. Важность ТСР в инфицировании человека была продемонстрирована тогда когда tcpA мутант классического V. cholerae 395 не имел успеха в колонизации волонтеров. Другие исследователи, хотя изучали значимость ТСР при заболевании, обусловленном El Tor биотипом, предполагают, что MSHA пили являются более важными в инфицировании El Tor. Osek et al. сообщали, что антитела полученные к ТСР ингибировали колонизацию, на модели мышат, классическими, но не El Tor штаммами, где антитела против MSHA могли блокировать колонизацию штаммами El Tor биотипа, но не классического. Пока аргументы для этих противоречивых результатов не известны; результаты Osek et al. предполагают, что есть специфичные факторы колонизации для каждого биотипа. (MSHA также экспрессируется 0139 серогруппой). Наши результаты показывают, что представленный адгезин OmpU экспрессируется у обоих биотипов, и 01 и 0139, и в меньшей степени в культуральных эпителиальных клетках и, по-видимому, играет существенную роль в адгезии 01 и безкапсульных 0139 штаммов. Конструирование изогенных штаммов, которые отличаются по одному или более адгезинов, может позволить определить относительную значимость ТСР, MSHA и OmpU в кишечной колонизации V. cholerae.
