Хроматография — способ разделения смесей, который изобрел русский ученый Михаил Семенович Цвет в 1900 году. Заключается в различии свойств компонентов смесей, разнице их реакций при нахождении в одинаковых условиях.
История хроматографии
Первое в истории упоминание о хроматографии (chromatography — «пишу цветом») было в 1901 году, когда российский ученый-биолог М. С. Цвет выступил с докладом на 11 съезде естествоиспытателей и врачей в г. Санкт-Петербурге. В этот период он исследовал растительные пигменты, изучал процесс фотосинтеза и пытался разделить хлорофилл на составляющие его пигменты. Ученый пропустил раствор пигментов через стеклянную емкость с адсорбентом, и пролил чистым раствором. Состав окрасился в разные цвета, разделившись на полоски. Это называется молекулярная хроматография. Статью о результатах своей работы ученый опубликовал в 1903 г.
С 1910 по 1930 гг. этот метод почти не исследовался.
Следующее упоминание в истории принадлежит европейским ученым Р. Куну, А. Виртенштейну, Э. Ледеру. В 1931 году, используя этот метод, они выделили из сырого каротина составляющие a- и b-каротин.
Важным этапом развития стало открытие в 1941 году английскими естествоиспытателями А. Мартином и Р. Сингом жидкостного варианта, где подвижное вещество — бумага, смоченная водой с бутанолом.
В 1975 году ученые из США ввели в терминологию новый вариант хроматографии — ионную.
Суть метода хроматографии
Метод хроматографии основан на постоянно повторяющихся с конкретной периодичностью процессах сорбции-десорбции, которые происходят между подвижным веществом с растворенной в нем пробой (элюентом) и неподвижным (сорбентом). Компоненты исследуемой смеси имеют различную степень сорбции (впитывания), за счет чего поглощаются сорбентом с различной скоростью и степенью. Суть метода заключается в многократном повторении этих процессов. Получившиеся пробы после изучения в хроматограмме позволяют уточнить состав реактива.
Теоретические основы хроматографии
В теории этот метод представляет собой последовательный процесс уравновешивания составляющих смеси, когда происходит деление на 2 части — подвижную и недвижную.
В колонке, или «тарелке», недвижная часть (фаза) уравновешивается с подвижной. Это константа распределения К (первая ступень). Далее подвижная часть устремляется в другую «тарелку» и приходит в равновесие (вторая ступень). И эти ступени повторяются многократно в хроматографии. Сущность метода выражается в «теории тарелок». Но это упрощенно, так как движение постоянное, что не дает 100% чистоту данных в измерении константы.
Понятия и определения метода зафиксированы ГОСТ 17567-81.
Выделяют адсорбцию, когда поглощение происходит на поверхности границ и абсорбцию, когда вещества расходятся между 2-х фаз.
Виды хроматографии
Виды хроматографии классифицируют по особенностям процесса разделения (по данным Википедии):
- агрегатное состояние неподвижной (сорбент) и подвижной (элюент) фазы: газовая, жидкостная, флюидная, полифазная;
- природа взаимодействия сорбента (удерживающее вещество) и сорбата, сорбтива (удерживаемое вещество): адсорбционная, ионообменная, распределительная, осадочная;
- способ введения элюента: фронтальная, вытеснительная, проявительная;
- техника проведения (капиллярная, колоночная, на бумаге);
- цели хроматографирования (аналитическая, препаративная, промышленная).
Классификация эта весьма условна. Все виды тесно связаны между собой. Так, в аналитической по цели использует проявительную по способу введения элюента. Кроме того, в каждом показателе могут выделяться дополнительные критерии. В технике проведения дополнительное влияние дают технические условия (высокое или низкое давление).
Капиллярная хроматография
Лекции по капиллярной начинаются с ответа на вопрос о том, для чего она нужна. Быстрое развитие метода привело к вопросу разделения смесей, состоящих из веществ, близких по физическим и химическим свойствам. Новую капиллярную колонку для решения этих задач изобрел М. Голей в 1957 году. Ее диаметр изменяется в пределах 0.05-0.15 мм, стандартный диаметр — 0.11 mm, а длина — 40-200 мкм. Самая длинная колонка достигала 477 м.
Данный вид позволяет решать различные экологические задачи — исследование воздуха на наличие летучих органических соединений (кратко — ЛОС), определение содержания пестицидов в почве. Разработаны методики:
- измерения концентраций ЛОС в воздухе — методика 1633-2013;
- определения содержания нефтяных продуктов в воде — ГОСТ 31953-2012;
- определения состава газа — ГОСТ 3-2008 с правками 2019 года.
Первоначально этот метод использовался для исследования качества нефтепродуктов, определения процентного содержания нефти в бензине.
Препаративная хроматография
Препаративная ставит цель выделять чистое вещество из смеси, причем в значительных количествах. Особенность — выполнение непрерывного разделения смеси. Для получения большего количества вещества увеличивают объем колонки в хроматографической установке.
Аналитическая хроматография
Используя аналитическую, проводят качественный и количественный анализ соединений — оксидов, кислот, окисей, полимеров.
В книге-учебнике Бражникова В. В., Сакодынского К. И. «Аналитическая хроматография» дано описание механизма работы хроматографа при качественном и количественном анализе.
В конце колонки расположен аппарат, измеряющий концентрацию вещества в элюенте — детектор. Время, прошедшее с момента поступления вещества в колонку до наступления максимальной концентрации вещества, называется время удерживания в хроматографии. Эта величина постоянна для каждого вещества, если в колонке поддерживается постоянная внешняя и внутренняя температура, и на основе этих данных делают качественный анализ.
Количественный анализ осуществляется через измерение площади и расположения пиков на хроматограмме.
Хроматография практическая
Современный метод хроматографии предназначен для решения практических задач. Сегодня использование этого метода актуально в биологии, криминалистике, химии, медицине, быту. Самые простые примеры доступны для проведения даже дошкольнику. Для опыта с чернилами разного цвета и простой водой в качестве растворителя не требуется современного оборудования, сложных расчетов и технологичной лаборатории. Школьники и студенты вузов проводят опыт по размыванию чернил на уроках химии.
Флюидная хроматография
К высокоэффективным видам относится флюидная. Процесс в данном случае проходит в сверхкритических условиях, где в качестве подвижной фазы берут газ, больше похожий на гель. Достоинство этого вида — определение верного состава любых микросоединений, которые не дают сигнал спектроскопам или другим детекторам.
С помощью флюидной хроматографии успешно анализируется состав лекарственных средств, продуктов, полимеров, сырой нефти, ПАВов.
Хроматография аминокислот
Данный метод играет большое значение при идентификации аминокислот и белков. Проводится техникой на листе бумаги по распределительному принципу. Определение вида аминокислоты проходит в несколько этапов:
- Подготовка хроматографической бумаги — нанесение радиальной разметки и стартовой линии.
- Нанесение раствора. Кончиком пипетки на стартовую линию в несколько подходов.
- Приготовление растворителя. Входит бутанол, уксусная кислота и вода в пропорциях 12:3:5.
- Разгонка аминокислоты. Необходимо отметить границу продвижения растворителя и аминокислот.
- Проявление. Высушивание меченой хроматографической бумаги в специальном шкафу.
- Определение коэффициента подвижности аминокислоты Rf по формуле Rf = а/b, где а — расстояние, пройденное аминокислотой, b — расстояние, пройденное растворителем в этой области бумаги и определение нужной аминокислоты по существующим таблицам.
Основные достоинства этого метода: точность получаемых данных и легкость расчетов.
Разновидности хроматографии по механизму разделения веществ
Разновидности:
- Адсорбционная. Определение вещества происходит по степени его адсорбции, т. е. возможности его поглощения поверхностью вещества.
В качестве адсорбента (вещества-поглотителя) часто используют алюминий и его производные: окиси фракции 0.063-0.2 мм (ТУ 6-09-3916-75, 6-68-164-2011, 6-68-164-99 и оксиды (ТУ 2163-004-81279372-11). В качестве растворителя обычно используют гексан (hexane) hp-ultra очистки (ТУ 6-09-3375-78 и 2631-001-54260861-2013), криохром. Купить особо чистые (ОСЧ) химические реактивы можно в фирме «Вектон».
- Распределительная основана на различных степенях растворимости определяемого вещества в подвижной и неподвижной фазах.
- Ионообменная основана на способностях к обмену ионами в атомах вещества с неподвижной фазой. Происходит замещение ионов в неподвижной фазе ионами вещества, при этом возникновение разницы в скорости приближения ионов к неподвижной фазе приводит к разделению элюента вследствие изменения концентрации вещества в фазах.
Процессы ионообменной хроматографии применяются для изучения биологических жидкостей (кровь, моча, плазма) и диагностики заболеваний.
- Осадочная изучает степень растворимости осадка, получившегося после проведения химической реакции с компонентом твердой фазы, а также скорости его осаждения.
- Аффинная основана на способности соединений притягиваться с высокой избирательностью к сорбенту. Элюирование (вымывание) вещества из общей массы — это аффинный метод хроматографии.
На характере взаимодействия между сорбентом и сорбатом основывается классификация по механизму разделения веществ.
Разновидности хроматографии по агрегатному состоянию фаз
По агрегатному состоянию фазы хроматографические методики бывают четырех видов.
Газовая: жидкостно-газовая и газо-твердофазная. Подвижной фазой выступает инертный газ (гелий, азот, водород, диоксид углерода) или воздух, который должен быть чистым, инертным по отношению к сорбенту и исследуемому веществу, хорошо растворять смесь. Неподвижной фазой служит либо жидкость, либо вещество.
Одним из направлений газовой является парофазный анализ, отличие которого заключается в том, что изучается не жидкий или твердый объект, а газовая фаза (пар).
Жидкостная — жидкостно-жидкостная и жидкостно-гелевая. Жидкостная фаза, служащая сорбентом, должна отвечать соответствующим требованиям (хорошо растворять компоненты смеси, иметь термическую устойчивость, небольшую вязкость и способность образовывать пленку с носителем). Теоретические основы ВЭЖХ раскрыты в книге — пособии С. Н. Сычева «Высокоэффективная жидкостная хроматография», сокращенно ВЭЖХ.
Флюидная. Подвижная находится в сверхкритических условиях — высокое давление, критическая температура.
Полифазная. Неподвижная фаза — смесь твердых и жидких компонентов.
Данные методы используются для исследования смесей органических соединений.
Качественный анализ в хроматографии
Качественный анализ пробы проводится на хроматографе, который измеряет и записывает характеристики, составляет схему. Полученную по результатам исследования хроматограмму изучают, высчитывают, используя формулы, закон Генри, уравнение Ван-Деемтера, сравнивают с эталонными градуировками и делают расшифровку.
Исходные графические данные, на основе которых проводят качественный анализ, называют элюционными характеристиками (параметрами). К ним относятся:
- время удерживания (activity, активности);
- ширина и высота элюционной кривой;
- ширина зоны на слое;
- удерживаемый объем;
- индекс удерживания;
- эффективность (число тарелок);
- селективность.
Методики постоянно улучшаются и дорабатываются — составляются специальные таблицы по результатам испытаний, что позволяет получать более точные данные для качественного проведения исследований.
Где применяется хроматография
Первоначально этот метод был применен в биологии первооткрывателем М. С. Цветом. В настоящее время он используется практически во всех сферах — промышленности, медицине, экологии, криминалистике, фармацевтике.
Хроматография в биологии
Хроматография в биологии в настоящее время применяется на постоянной основе. Основным методом хроматографии в биологии является газовый. Это проведение тестов на уровень содержания пестицидов в почве, вредных веществ в воде и воздухе. Метод ЖХ/МС/МС, объединяющий жидкостное хроматографирование и тандемную масс-спектрометрию, вместе с центрифугированием используется при расщеплении липидов, белков, углеводов до простых компонентов для дальнейшего их исследования, которым занимается наука протеомика.
Хроматография в химии
Хроматография – это в химии один из основных методов исследования, позволяющий получить точные и проверенные данные. Представители IUPAC (Международного союза теоретической и прикладной химии) участвовали в разработке стандартов обозначения хроматографических процессов.
Различные виды метода применяются для исследования свойств анаэробных и аэробных веществ, извлечения из смеси веществ необходимого препарата. Каждое предприятие химической промышленности использует хроматографические методы на этапе контроля качества сырья и других технологических процессов.
Хроматография в медицине
В клинической медицине эти методы применяются в тесной взаимосвязи с биологией. Изучение беременности, хромосом, медицинское лечение различных микробных инфекций, патологий, отравлений происходит без использования антибиотиков и сывороток, основываясь на принципах жидкостно-адсорбционной хроматографии, где неподвижная фаза — адсорбент, жидкая — кровь, плазма, лимфа, а разделяемая смесь — внутренние жидкости с метаболитами токсинов.
Хроматография в криминалистике
Криминалистические хроматографические методы предполагают решение государственных задач через проведение исследований в следующих областях:
- поиск и идентификация отпечатков пальцев тела;
- медико-биологический анализ ДНК для идентификации личности человека;
- аппаратурное определение состава ядов, наркотиков, взрывчатых веществ;
- анализ состава чернил, бумаги, алкоголя.
В криминалистике широкое применение получили две разновидности жидкостного метода: хроматографирование в тонких слоях сорбента и 2-й — хроматография на бумаге.
Хроматография в цитологии
В цитологии метод применяется при изучении клеточного строения в витальной форме («при жизни»).
Хроматография нефти
На НПЗ хроматографический метод применяется для определения физических свойств нефти (теплопроводности, плотности), уровня содержания серосодержащих примесей. Так как от этого напрямую зависит качество продуктов — бензина, моторного топлива, трансформаторного масла.
Хроматография в фармации
В фармацевтической отрасли хроматографические методы применяются в нескольких науках: фармакопея (лат. pharmacopoeia), фармация и фармакогнозия. В фармакопейном анализе широкое применение получил ионообменный вид и метод спектрометрии, с помощью которых удается выделить из смеси микроскопически малые части за небольшой промежуток. В косметологии в состав средств для ухода за волосами входит метилпропансульфокислота, получаемая препаративным методом.
Где используется хроматография в быту
В домашних условиях возможно бесплатно провести самые простые эксперименты, демонстрирующие сущность разных видов хроматографии.
Опыт с бумагой (можно взять обыкновенную промокашку) и спиртовым экстрактом календулы прекрасно демонстрирует принцип действия бумажной.
Если капнуть на бумагу сначала эфирный раствор календулы, а затем этиленгликоль, в итоге через небольшой промежуток времени на бумаге образуется несколько разноцветных колец. Прослеживается прямопорциональная зависимость количества веществ в смеси и количества колец.
Селективность в хроматографии
Селективность — это свойство одного объекта подбирать свойства другого объекта, работающего в тандемной связке, под свои потребности для решения задачи.
В хроматографии используют термин селективность колонки, и чем она выше, тем лучших результатов можно достичь. Возможность выбирать сорбент, состав растворителя, химическую структуру и свойства компонентов смеси, температуру колонки — это факторы, изменение которых выводит селективность на высокий уровень.
Индекс удерживания в хроматографии
Индекс удерживания вещества — это величина, измеряющая время нахождения молекулы изучаемого вещества в подвижной фазе.
Неподвижная фаза в хроматографии
Неподвижная фаза — это вещество, которое выступает в роли сорбента для анализируемых веществ. Неподвижной фазой выступает твердое вещество с пористой поверхностью, в некоторых случаях жидкости.
Электрофорез и хроматография
Электрофорез, используя ток, и хроматография решают одни и те же задачи — разделение смеси веществ, выделение их составляющих. Но при этом есть существенное отличие. Процесс электрофореза — электрохимический, он состоит из неподвижной и мокрой подвижной фазы, а 2-ой использует стационарную и подвижную фазы.
Применяют в медицине в биохимии жидкостей (крови, плазмы).
Что общего между экстракцией и хроматографией
Экстракция – это разделение смеси жидких или твердых веществ. Активируют селективные растворители (экстрагенты). Общее с хроматографическими методами — деление исследуемого вещества на части и его выделение из общей массы.
ТСХ хроматография и ГСО
ТСХ (расшифровка – тонкослойная хроматография) протекает при перемещении подвижной фазы на тонком слое (до 0,20 см) неподвижного сорбента, нанесенного на твердую поверхность — пластинку (стекло, металл, малеинизированный полимер, акриламидо).
Испытание лекарственных средств на абсолютную подлинность и посторонние примеси — основная задача этой методики.
В исследованиях, для обеспечения чистоты полученных результатов, в качестве сорбента и растворителя используют вещества высшего класса по государственным стандартным образцам (ГСО).
Виды детекторов в хроматографии
Пробы исследуются в хроматографе, который фиксирует и анализирует все изменения пиков, используя градуировочные детекторы. Основные из них:
- пламенно-ионизационный;
- фотоионизационный;
- электронного захвата;
- термоионизационный;
- инфракрасный;
- рефрактометрический;
- электронозахватный;
- масс-спектрометрический;
- хемосорбционный;
- радиоактивный.
Это насадочные приборы, применяемые в хроматографии. Каждый год, и в 2017, и 2020 годах, изобретаются новые модификации и формы детекторов.
Достоинства хроматографии
К преимуществам относят:
- одновременное разделение вещества на фракции и его изучение;
- эффективность разделения из-за многократного повторения цикла сорбция — десорбция;
- определение и выделение из смеси заданного типа препарата одновременно;
- относительная быстрота достижения цели;
- высокая чувствительность (100х6);
- отсутствие химических превращений анализируемого вещества.
Это отличает хроматографические методы от других.
Недостатки хроматографии
Есть отдельные недостатки у каждого вида.
Газожидкостный метод:
- необходимо сложное оборудование и проведение долгого обучения;
- невысокая скорость протекания реакций;
- большая цена.
Тонкослойный метод:
- плохая нелабораторная воспроизводимость результата;
- невозможность разделения веществ с близкими свойствами.
Диапазон применения хроматографических методов очень широк: от исследования составляющей клетки до объектов Солнечной системы. Эти методы незаменимы в нефтехимической, пищевой, газовой, экологической промышленностях на этапе контроля и поддержания оптимального графика производства.
